集合安全性
(即脱靶效应)
和交付效率。但在临床应用场景中，编辑安全通常是第一位的。今年8月和11月，FDA暂停了Beam Therapeutics的CAR-T基因编辑疗法IND和Verve Therapeutics的Pcsk9基因编辑疗法pipeline的一期临床试验，并要求新药研发机构提供更多数据，以评估基因编辑疗法过程中脱靶编辑和染色体易位的风险。
由于CRISPR系统巨大的临床应用潜力，在基因编辑中评估脱靶效应的探索几乎与CRISPR系统可用于编辑哺乳动物基因组的证实不谋而合。到目前为止，科学家已经开发了许多方法来评估伴随基因编辑的潜在脱靶编辑事件。这些方法可以分析不同基因编辑场景下的基因组DNA，一般归类为细胞外。
（
在试管内
例如圆形序列)
体外培养的细胞。
(在单元格中，如指南序列)
在体内的组织和细胞中。
（
在活生物体内
例如Discover-seq)
三班。这些方法的共同思想是，在基因编辑过程中，所有被编辑的站点
(包括目标和非目标站点)
标签，然后富集标签化的基因组序列，检测基因组的哪些区域进行了CRISPR相关的基因编辑。
目前，GUIDE-seq作为一种广泛使用的方法，在基因编辑过程中向细胞中加入了大量的外源dsODN。
(双链寡二氧核苷酸)
以完成标记过程。然而，由于外源dsODN对细胞的毒性，GUIDE-seq不能用于体内基因编辑的脱靶检测。另一项技术Discover-seq，据报道可用于体内检测，是通过DNA修复蛋白MRE11的免疫沉淀来鉴定脱靶编辑的基因组位置。因此，它能找到的脱靶编辑位点仅限于某一个时间处细胞内正在修复的DNA双链断裂的瞬时快照，但它不能反映整个编辑过程中发生的所有编辑事件时间窗口。
主要编辑
(体育)
这是刘中达博士的研究团队在2023年发布的一种新的基因编辑工具。它本身的应用场景是基因编辑，而不是识别脱靶位点。PE系统将发送Cas9 nickase
(Cas9n)
创新性地将待编辑的DNA信息添加到gRNA的3’端。
(佩格纳)
作为逆转录酶的逆转录模板，目的DNA序列会通过逆转录导入基因组。在随后的几年中，通过刘中达和高彩霞等实验室的一系列优化工作，PE系统已经能够实现非常高的编辑效率。
最近，
自然通讯
在西湖大学生命科学学院在线发表。
加马力
实验室的一篇文章，题为：
PEAC-seq采用Prime Editor检测CRISPR脱靶和DNA易位。
李嘉实验室的研究人员已经改革了体育制度。首先，他们将pegRNA上的逆转录模板转化为优化的固定插入序列。
(标签)。在PE系统的作用下，这个标签序列会出现在所有发生过编辑的基因组位点上。然后，他们用野生型Cas9代替Cas9n与MMLV融合，这样检测到的脱靶编辑全部来自于Cas9引起的双链DNA断裂。最后，在Tn5转座酶的配合下，使用两对富集引物，通过PCR反应富集所有带有tag的基因组位置，最后从高通量测序数据中鉴定。整个方案被命名为PEAC序列。
(图1)
，是引物编辑器辅助脱靶测序鉴定的缩写。
图PEAC-序列流程图
研究人员在HEK293T细胞中选择了六个广泛用于测试脱靶编辑的位点，将PEAC-序列识别的脱靶位点与指南-序列的结果进行了比较，并通过扩增子-序列进行了验证，发现PEAC-序列和指南-序列的结果非常一致。
在仔细检查PEAC-序列的测序信号的过程中，研究人员意外地发现，在一些脱靶位点，一些信号并不来自插入PE系统的PEAC-序列标签。因为tag的插入是定向的，所以用于富集tag的两对PCR引物只能扩增tag上游或下游的基因组序列。随着分析的深入，研究人员推测异常信号很可能来自基因组中几个编辑位点在其DNA双链断裂后的三维邻近，并提出了PEAC-seq系统中几种可能的DNA易位连接模式。
(图2)。
图PEAC-seq检测到DNA易位的五种可能情况(底部的粉色数字表示异常信号)
经过验证，研究人员证实了他们的猜测，并发现许多目标位点发生了染色体易位。
(符合目标)
和非目标网站。
(偏离目标)
尚都存在
(图3)。而染色体易位的发生概率与基因座本身的编辑效率并没有明显的正相关关系，提示还有其他因素。与脱靶效应相比，染色体易位引起的基因组毒性会在更大范围内影响基因表达，导致细胞功能异常。但是，以前的基因编辑脱靶检测方法需要通过已知的基因组上下游序列逐个识别染色体易位，无法对染色体易位进行全基因组评价。PEAC-seq弥补了这一不足，为系统识别基因编辑导致的染色体易位提供了解决方案，也为更安全的基因编辑提供了参考。
图DNA易位的鉴定和验证
最后，研究人员通过显微注射将体外转录的Cas9-MMLV的mRNA和pegRNA递送到小鼠受精卵中。第一段时间之后，收集了小鼠胚胎的脱靶编辑。该实验证实了PEAC-序列也可以安全地用于检测体内基因编辑场景中的脱靶位点。
(图4)。
图PEAC-seq体内应用
研究人员还进一步分析了基因组中脱靶编辑和染色体易位的规律。他们发现脱靶编辑的位点，与基因编辑的细胞系一起，代表染色体开放区。
((ATAC序列)
基因转录调控区
(H3K4me3、H3K9ac和H3K27ac，POLR2A，EP300，H2AFZ)
信号有明显的共富集现象。另一方面，染色体易位与细胞本身双链断裂的热点共同富集。
不管怎样，
PEAC-seq为Cas9基因编辑的脱靶位点提供了一种新的检测方案，已被证明在体外培养细胞和体内受精卵中识别脱靶位点是安全和准确的。更重要的是，PEAC-序列提供了一种解决方案，用于鉴定由基因编辑引起的染色体易位。
随着基因编辑技术在越来越多的基因治疗临床试验中的应用，以前被忽视的染色体易位现象需要在灵敏的检测手段产生的数据支持下进一步分析。
西湖大学博士生余振兴、鲁治科、王莹莹和同济医科大学附属同济医院生殖医学中心李晶晶博士为论文的共同第一作者。西湖生命科学学院和西湖实验室基因编辑中心的马研究员是本文的通讯作者。
西湖大学生命科学学院马实验室，关注真核生物基因表达调控所依据的基因组解码过程。实验室擅长开发和利用高通量实验技术，尤其是功能基因组学技术，结合计算生物学和机器学习，通过数字化生物过程来理解基因组的奥秘。欢迎有共同兴趣的研究人员报考博士生和博士后岗位申请。
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