在生命科学技术领域，基因编辑工具CRISPR-Cas系统已广为人知，称为“基因魔术贴”，能够以特定基因为靶点进行DNA/RNA序列的修改。 目前，美国已有多家基因编辑工具公司上市，但技术基础IP主要被欧美企业垄断，原则上使用CRISPR-Cas系统的基因治疗、基因检测企业必须得到相关国外企业的认可。
据了解，在商业化过程中，制药公司需要获得基因编辑方面的专利许可，并支付数百至数千万美元的首付，之后的里程碑支付总计可能达到数亿元。 2023年10月，美国干细胞治疗公司Sana Biotechnology与华裔教授刘如谦、张锋等创办的基因编辑公司Beam Therapeutics合作，Sana向Beam支付5000万美元预付款，CRISPR-Cas12b核酸酶
我国制药企业在产品商业化特别是国际市场销售过程中，也需要向国外基因编辑工具企业支付相应的专利许可费。 因此，自主控制该领域的核心技术，开发更安全有效的基因编辑工具，已成为我国科学家发挥作用的方向之一。
辉大基因创始人杨辉博士(国内知名科研机构神经所高级研究员)从2013年开始使用CRISPR-Cas工具研究基因编辑动物，回国近10年的时间里，团队专注于基因编辑工具的开发和基因治疗。 2023年杨辉博士、姚璇博士等构建了辉大基因，2023年团队发现了Cas13蛋白两个家族Cas13X、Cas13Y，是继Cas13a/b/d之后的新的RNA编辑工具。
2023年1月，辉大基因CRISPR-Cas13X、Cas13Y基础技术由美国专利局授予专利； 与国内某细胞治疗企业首次签订《对外一般技术许可协议》； 5月辉大基因完成数亿元C轮融资。 36氪采访了辉大基因联合创始人、CEO姚璇博士，阐述了公司基因编辑工具的特点和基因治疗药物管道开发的新进展。
开发基因编辑工具，成为“桌面玩家”“在过去的十年里，我们的团队基本上尝试了CRISPR-Cas的所有亚族、亚型以及优化方法； 在此基础上，建立了系统的方法论，包括如何发现新的CRISPR-Cas蛋白、离靶、编辑效率、PAM (原型间隔区邻近基序)识别等如何改进，中间有许多know-how的”姚璇博士总结说，在后期的验证过程中，团队也开发了一系列的检测系统，在很多Cas中定位高活性的编辑蛋白。
那么，CRISPR-Cas13X、y与同类RNA编辑工具相比有什么特性？
" Cas13X是目前最小的Cas13蛋白； 编辑效率方面，Cas13X/Y体外试验敲除活性接近100%，体内编辑效率约为95%。 不仅可以实现RNA的knock down，还可以通过改造Cas13X/Y，结合氨溴索实现RNA单核苷酸的编辑。 例如，杜氏肌营养不良症( DMD )的基因治疗，目前辉大的单核苷酸编辑工具几乎可以实现接近80%的RNA单核苷酸编辑效率。 ”
此外，由于Cas13蛋白一般存在切旁活性问题，即基因编辑中的“脱靶效应”，证明Cas13d可导致体外细胞凋亡，导致Cas13d转基因小鼠存活率明显降低。 针对这一问题，辉大研发团队对Cas13d及自研的Cas13X.1进行了改造，全转录RNA测序、体外细胞实验及转基因小鼠观察等试验结果表明，改造后的高保真版Cas13d及Cas13X.1
Cas13X/Y分析图
除了RNA编辑工具之外，辉大集团的子品牌“HuiEdit”还开发了DNA编辑器Cas12Max。 与多种DNA编辑器相比，Cas12Max蛋白体积小，适用于基于AAV (腺相关病毒)载体递送的体内基因编辑。
“将Cas9系统应用于体内基因治疗可能需要两个AAV载体进行递送。 Cas12Max的体积与SaCas9相同，比spCas9小1kb(kilobase，即千碱基)，用一个AAV载体包装即可。 这有利于CMC在生产技术、AAV递送及体内基因治疗中的应用。”姚璇博士对36氪说。
Cas12Max系统，目前已应用于体内基因治疗的研发，应用于包括肝脏、神经、肌肉领域在内的多种适应证。 在未来的商业规划中，一方面公司提供细胞治疗、植物育种等企业License-out基因编辑工具，同时自身研究基因治疗管道，在临床二、三期或进入商业化进程中，与跨国药企合作共同开发。
两条基因治疗线将IND目前的辉大基因研发线，主要集中在神经、眼科、肌肉、听力4种，其中眼科两条基因治疗线已进入IND申报阶段，针对适应证分别为先天性黑蒙症2型( LCA2)、老年湿性
在基因治疗的管道选择上，药企多从罕见病入手，而80%以上的罕见病为单基因遗传病，基因治疗可以纠正潜在的遗传缺陷，是有效的治疗手段； 此外，目前是一种引起多种致死、致残的少见疾病，临床上缺乏治疗药物。 在这种情况下，在患者、监管等层面上，尝试基因治疗这样的新疗法的动力越来越高。
先天性黑蒙病是一种罕见的遗传性视网膜病，导致婴幼儿先天性视觉障碍，在中国有数千名患者。 目前，能治疗该病的药物只有AAV转导RPE65基因的基因治疗药物Luxturna，但其售价高达42万美元/针，是普通家庭难以承受的“天价”。 为了改变这种现状，辉大基因等同类公司正在加速开发LCA的基因疗法。
姚璇博士表示，辉大基因的LCA2管道预计将于今年年底提交IND，在体内试验的安全性和有效性方面，“我们将利用新的AAV血清型提供RPE65基因，在动物体内的试验数据显示，其用量为现有治疗方法的1/100 ”。
小剂量一方面意味着CMC压力降低，无需大规模生产研制足够的样品，一方面可以降低药品生产成本，另一方面也有利于患者安全。
辉大基因对老年湿性黄斑变性( wet AMD )的基因治疗线通过高保真版Cas13X靶基因VEGFA降低VEGFA的表达量，目前正在研发中，预计2023年初提出IND； 该疗法已在动物试验中积累了近一年的安全性和有效性数据。
目前，治疗老年湿性黄斑变性的单抗药需要约4-6周给药，存在药物依赖性问题，剂量过大可能导致视网膜脱离等风险。 目前，在非人灵长类实验中，辉大基因AAV递送药物的有效性已维持近1年，有望解决重复给药问题。
此外，辉大基因的研究管道还包括AS (天使综合征)、ALS ) )萎缩侧索硬化症，俗称ALS )，以及肌肉区域杜氏肌营养不良症、听力障碍类疾病。
辉大基因研究管道形象，企业供图
基因治疗的技术平台和团队开发新药的链条，涉及到从研发到扩大生产技术等多项技术创新。 姚璇博士将辉大基因的技术平台归纳为动物模型、基因编辑、配送系统、化学成分的生产和控制。 除了上述基因编辑的基础技术能力外，还介绍了辉大在其他三个技术平台上的积累。
针对不同适应证开发新药时，首先建立相应的动物疾病模型，通过体内实验验证药物的安全性和有效性。 “杨辉教授于2013年开始利用CRISPR技术构建啮齿类小鼠和非人灵长类猴子等基因编辑动物。 在此基础上，辉大在不同疾病领域建立了多种动物模型用于管道的研发。 ”
在基因治疗研发过程中，“递送系统”是绕不过去的技术难点，目前，辉大基因主要采用AAV病毒载体进行体内递送，针对不同类型疾病开发高安全性、低免疫原性、高组织特异性的AAV载体
在生产方面，建立了质粒工艺平台、AAV工艺平台及分析检测平台，初步完成了50L悬浮培养的工艺摸索及几十种分析方法的建立； 不断优化将促进目标产品产量满足需求，质量达标。
在生物医药行业融资遇冷、资本市场趋于理性的情况下，辉大基因于2023年5月完成了数亿元的丙轮融资。 为什么机构能持续投资，姚璇博士认为，核心是辉大基因在CGT领域的差异化，基因编辑工具在CGT行业，就像汽车引擎和芯片技术一样。 “现阶段，公司在基础工具和管道研发技术方面具有竞争力； 同时充实CMC技术研发、临床研究等队伍，丰富研发流水线布局，改进新技术平台、新发布系统。 ”
姚璇博士表示，未来3-5年我国基因编辑、基因治疗领域将持续突破和发展。 辉大基因正在开放基因编辑工具的能力，希望与更多的生物创新药企、基因检测公司以及各领域专家合作，壮大中国市场空间。
